十字花科植物种子中含有哪些荧光物质？

实验17 种子生活力的快速测定种子生活力是指种子能够萌发的潜在能力或种胚具有的生命力。它是决定种子品质和实用价值大小的主要依据，与播种时的用种量直接有关。测定种子生活力常采用发芽实验，即在适宜条件下，让种子吸水萌发，在规定天数内统计发芽的种子占供试种子的百分数。但是常规方法（直接发芽）测定种子生活力所需时间较长，特别是有时为了应急需要，没有足够的时间来测定发芽率，遇到休眠种子也无法知道。而采用以下的化学方法，则能在较短时间内获得结果。 Ⅰ 氯化三苯基四氮唑法（ TTC 法） 一、原理 凡有生命活力的种子胚部，在呼吸作用过程中都有氧化还原反应，在呼吸代谢途径中由脱氢酶催化所脱下来的氢可以将无色的 TTC 还原为红色、不溶性三苯基甲 （ TTF ），而且种子的生活力越强，代谢活动越旺盛，被染成红色的程度越深。死亡的种子由于没有呼吸作用，因而不会将 TTC 还原为红色。种胚生活力衰退或部分丧失生活力，则染色较浅或局部被染色。因此，可以根据种胚染色的部位以及染色的深浅程度来判定种子的生活力。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 玉米、小麦等种子。 （二）试剂 0.5% TTC 溶液：称取 0.5 gTTC 放在烧杯中，加入少许 95% 乙醇使其溶解，然后用蒸馏水稀释至 100 mL 。溶液避光保存，若变红色，即不能再用。 （三）仪器设备 恒温箱，培养皿，刀片，烧杯，镊子，天平。 三、实验步骤 1. 浸种 将待测种子在 30 ～ 35 ℃温水中浸种（大麦、小麦 6 小时，玉米 5 小时左右），以增强种胚的呼吸作用。 2. 显色 取吸胀的种子 200 粒，用刀片沿种子胚的中心线纵切为两半，将其中的一半置于 2 只培养皿中，每皿 100 个半粒，加入适量的 0.5% TTC 溶液，以覆盖种子为度。然后置于 30 ℃恒温箱中 1 h 。观察结果，凡胚被染为红色的是活种子。 将另一半在沸水中煮 5 min 杀死胚，作同样染色处理，作为对照观察。 3. 计算活种子的百分率，如果可能的话与实际发芽率作一比较看是否相符？ Ⅱ 溴麝香草酚蓝法（ BTB 法） 一、原理 凡活细胞必有呼吸作用，吸收空气中的 O 2 放出 CO 2 。 CO 2 溶于水成为 H 2 CO 3 ， H 2 CO 3 解离成 H + 和 HCO 3 ˉ，使得种胚周围环境的酸度增加，可用溴麝香草酚蓝（ BTB ）来测定酸度的改变。 BTB 的变色范围为 pH6.0 ～ 7.6 ，酸性呈黄色，碱性呈蓝色，中间经过绿色（变色点为 pH 7.1 ）。色泽差异显著，易于观察。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 玉米种子。 （二）试剂 0.1% BTB 溶液：称取 BTB 0.1 g ，溶解于煮沸过的自来水中（配制指示剂的水应为微碱性，使溶液呈蓝色或蓝绿色，蒸馏水为微酸性不宜用），然后用滤纸滤去残渣。滤液若呈黄色，可加数滴稀氨水，使之变为蓝色或蓝绿色。此液贮于棕色瓶中可长期保存。 （三）仪器设备 恒温箱，天平，刀片，烧杯，镊子，培养皿，滤纸，漏斗。 三、实验步骤 1. 浸种 同上述 TTC 法。 2. BTB 琼脂凝胶的制备 取 0.1% BTB 溶液 100 mL 置于烧杯中，将 1 g 琼脂剪碎后加入，用小火加热并不断搅拌。待琼脂完全溶解后，趁热倒在 4 个干洁的培养皿中，使成一均匀的薄层，冷却后备用。 3. 显色 取吸胀的种子 200 粒，整齐地埋于准备好的琼脂凝胶培养皿中，种子胚朝下平放，间隔距离至少 l cm 。然后将培养皿置于 30 ～ 35 ℃下培养 1 ～ 2 小时，在蓝色背景下观察，如种胚附近呈现较深黄色晕圈是活种子，否则是死种子。 4. 计算活种子百分率。 用沸水杀死的种子作同样处理，进行对比观察。 Ⅲ 红墨水染色法 一、原理 有生活力的种子其胚细胞的原生质具有半透性，有选择吸收外界物质能力，某些染料如红墨水中的大红 G 不能进入细胞内，胚部不着色。而丧失生活力的种子其胚部细胞原生质膜丧失了选择吸收的能力，染料进入细胞内是胚部染色，所以可根据种子胚部是否染色来判断种子的生活力。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 玉米、小麦等种子。 （二）试剂 5% 红墨水。 （三）仪器设备 恒温箱，培养皿，刀片，烧杯，镊子。 三、实验步骤 1 ．浸种 同上述 TTC 法。 2 ．染色 取已吸胀的种子 200 粒，沿胚的中线切为两半，将一半置于培养皿中，加入 5% 红墨水（以淹没种子为度），染色 10 ～ 15 min （温度高时间可短些）。 3 ．观察 染色后倒去红墨水，用水冲洗多次，至冲洗液无色为止。检查种子死活，凡种胚不着色或着色很浅的为活种子；凡种胚与胚乳着色程度相同的为死种子。可用沸水杀死的种子作对照观察。 4 ．计算有生活力种子的百分率。 Ⅳ 纸上荧光法 一、原理 具有生活力的种子和已经死亡的种子，它们的种皮对物质的透性是不同的，而许多植物的种子中又都含有荧光物质。利用对荧光物质的不同透性来区分种子的死活，方法简单，特别是对十字花科植物的种子，尤为适用。 二、实验材料与仪器设备 （一）实验材料 油菜、白菜等十字花科植物的种子。 （二）仪器设备 紫外荧光灯，镊子，培养皿，滤纸（无荧光）。 三、实验步骤 1. 将完整无损的种子（油菜、白菜等十字花科植物的种子） 100 粒，于 25 ～ 30 ℃水中浸泡 2 ～ 3 小时。 2. 把已吸胀的种子，以 3 ～ 5 mm 间隔整齐地排列在培养皿中的湿滤纸上，滤纸上水分不能过多，以免荧光物质流散彼此影响。培养皿可以不必加盖，放置 1.5 ～ 2 小时，取去种子，将滤纸阴干。取出的种子仍按原来顺序排列在另一培养皿中（以备验证）。 3. 将阴干的滤纸置于紫外荧光灯下进行观察，观察如能在暗室中进行，则效果更好。在放过种子的位置上如见到荧光圈，则为死种子。如要确证它们是死种子，可将排列在另一培养皿中的这些种子拣出来，集中在一只培养皿的湿滤纸上，而让不产生荧光圈的种子留在培养皿中，维持湿度，让其自然发芽。 4. 3 ～ 4 天后记录培养皿中发芽种子数。此方法的成败，首先决定于种子中荧光物质的存在，其次决定于种皮的性质。有些种子无论有无发芽能力，一经浸泡，即有荧光物质透出，大豆即属此类；也有些种子由于种皮的不透性，无论种子死活，都不产生荧光圈，许多植物的种子都会碰到这种个别现象，此时只要用机械方法擦伤种皮，可重复验证。相反，有时由于收获时受潮，种皮已破裂，也会产生荧光圈，试验时都应该注意。最好将浸泡液进行检查，没有荧光则适于作试验材料。 [ 思考题 ] 1. 试验结果与实际情况是否相符 ? 为什么 ? 2. 就你所知还有哪些快速方法，可以测定种子的发芽率 ? 3. 试比较 TTC 法、 BTB 法、红墨水法以及纸上荧光法，测定的结果是否相同 ? 为什么 ?